一、粪便标本的采集
粪便取样时采集到病理成分是提高阳性率的基础,配备的采集杯大有讲究,不仅要适用于各种类型的标本,而且最好可以多点取样,便于采集到病理成分。目前,常见配套的粪便采集器有勺状、螺纹状、多爪式等。勺状取样器无法多点采样,螺纹状取样器无法取水样便及稀便,多爪式勺状,稀便硬便都可方便采集,且能多点取样,病理成分更容易被采集到。
二、粪便标本的前处理
粪便样本性状多样,差异明显,若前处理不当,在显微镜下成像时,会极大地影响图片效果及标本特征提取,从而干扰识别。常见的粪便标本处理包括直接涂片法和稀释过滤法。直接涂片法以机器模拟手工操作方式,仪器自动取样,在稀释池稀释成悬浊液后在载玻片上涂片后转送至显微镜下采图。这种方法保证了样本的原始性,但在涂片的过程中,有形成分易变形和被破坏,粪便标本受食物残渣的影响,难以保证图像的清晰度。稀释过滤法由仪器自动加入稀释液,自动混匀、过滤,加样至流动计数池或一次性计数板,传送至显微镜下进行采图。这种方法过滤掉了部分残渣,可为镜检提供较好的视觉背景,但对粪便搅拌时间及力度要求较高,搅拌不充分,病理成分无法释放,搅拌过度,病理成分易被破坏,所以,最好可根据粪便的性状,自动调整搅拌速度、搅拌时间及沉降时间等,对每份标本进行个性化处理,得到最佳处理样本悬液。
对粪便病理成分进行富集是提高阳性检出率的关键,目前,样本的过滤回收方法包括静态过滤法及动态过滤法。静态过滤法的过滤网固定在底部或一侧,被动接受有形成分,回收率低,且粪便残渣容易堵塞网孔,造成有形成分无法回收。动态过滤网有大小孔径的双层滤网,在搅拌过程中形成对冲液流,可主动捕捞有形成分,既能有效过滤食物残渣又可防止网孔堵塞,可对病理成分(尤其是虫卵)有效富集,提高回收率及检出率。
图像的采集及处理是粪便检测实现自动化的难点,粪便标本成分复杂,如何采集到病理成分、采集图片的数量及图像的自动识别都至关重要。粪便标本干扰因素较多,在复杂的背景下捕抓到病理成分并采集图像是关键,可根据粪便病理成分的大小、轴比、形状、纹理、梯度、颜色、灰度等特征参数设置特定语义模型,在复杂背景下选择性抓取疑似病理成分的目标并采集图像。红细胞、白细胞、虫卵等病理成分经沉淀后聚集在标本悬液下层,而脂肪球漂浮在标本悬液上层,为保证不漏检,需进行上下双层面扫描,分层进行拍照和采集目标参数。原则上,仪器采集的视野越多,漏检可能性越低,但难点在于既要保证采集视野数又要保证检测速度。目前,粪便分析仪常见的显微镜物镜有20倍单镜头和10倍+40倍双镜头,应用双镜头的仪器在低倍镜下扫描后再转高倍镜采图分析,问题在于受食物残渣等影响,10倍低倍镜下无法判断识别病理成分,而40倍高倍镜观察的视野数又有限,容易导致漏检。相比而言,20倍单镜头无需高低倍镜转换,既能保证病理成分清晰可见,又能使观察视域更大,检测的视野更多,提高阳性检出率。图像自动识别的准确度依赖于应用特征参数的多少及图片库的大小,仪器同人一样,见识越多,自动识别率越高。
开展室内质控是保证粪便检验质量的必要措施,仪器需具备配套的粪便有形成分质控物、粪便隐血质控品及转铁蛋白质控品,对仪器进行质量控制,以保证检测结果的准确性。粪便有形成分质控物需具备阴性质控物、灵敏度质控物及精密度质控物三种,分别用于阴性对照、检出率验证及重复性验证。粪便隐血质控品及转铁蛋白质控品要包括阴性、低值、中值及高值四个浓度,分别用于粪便隐血及转铁蛋白检测项目的阴性对照、灵敏度检测、中等浓度及高浓度验证。
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